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单克隆抗体药物生产中细胞培养对抗体糖基化的影响
发布时间:2019-08-11 03:13 编辑:澳门太阳城

   

  1986年,世界上首个单克隆抗体药物——抗CD3单抗OKT3获得美国食品和药物管理局(FDA)的上市批准,单克隆抗体药物产业化从此拉开序幕。作为主要应用于恶性肿瘤、自身免疫性疾病、炎症性疾病等治疗领域的抗体类药物,目前,全球已经批准的单克隆抗体药物超过了80个,年销售额增长率超过30%,单克隆抗体在生物制药领域发展得越来越快。随着抗体工程的发展,嵌合单克隆抗体以及人源化单克隆抗体相继问世,而以B淋巴细胞cDNA库和噬菌体展示技术的发展使全人源单克隆抗体成为可能,第一支全人源单克隆抗体——阿达木单抗(adalimumab)已成功研制并于2002年由FDA批准上市。全人源单克隆抗体具有良好的功效,且无副作用,已成为当前发展最迅速的一类单克隆抗体药物。

  单克隆抗体是蛋白类大分子,具有复杂的结构特征,主要由Fab和Fc两大功能区组成,在Fab段和Fc段特定的位点存在糖基化修饰。糖基化修饰形成的糖链仅仅占整个单克隆抗体的3%,尽管比例不高,但糖链结构却发挥着极其重要的作用:能够维持抗体的空间构象、稳定抗体的结构,研究表明抗体脱糖基化后对热的稳定性大大降低;糖链结构还能保护抗体不受某些蛋白酶水解;糖链中特别的糖型还与免疫效应功能密切相关,糖型并非在人体内生物合成,因此可能具有一定的免疫原性,可加速单抗的血浆清除。总的来说,糖基化修饰不仅对维持单克隆抗体的结构有重要作用,同时一些特定的糖基化修饰类型以及不同的糖基化修饰程度均会影响抗体的安全性特征,而且,糖基化修饰也影响药物的有效性。

  单克隆抗体药物的糖基化具有高度的异质性,在单克隆抗体的糖基化中,由于糖基化种类的多样性以及连接方式的多样性,因而形成了自然界中最复杂和最多样化的蛋白结构。单克隆抗体药物的糖基化结构对于药物的疗效和安全具有重要意义。

  有趣的是,尽管单克隆抗体药物的轻链和重链的氨基酸序列是对称的,但是Fc片段上N端糖基化修饰并非全部都为对称。单抗药物的N端糖基化修饰通常是复杂的双天线糖链结构,可能发生岩藻糖化和唾液酸化。通过表1,也可以看到单克隆抗体药物常见糖基化修饰对抗体药物结构和功能有着很大的的影响。

  研究发现糖链中不同末端糖基化对IgG功能有不同的影响,IgG因不同的连接方式存在3种不同类型的N端糖型,分别为高甘露糖型、甘露糖杂合型、甘露糖复杂型,大多数的杂合型和复杂型存在核心岩藻糖基化,少数没有。

  所以说单克隆抗体药物糖基化对于其疗效及生产就显得极为重要,各大生产商都非常重视单克隆抗体药物糖基化的质量监控。在抗体药物生产过程中首选哺乳动物细胞表达系统,在哺乳动物细胞表达系统中因其具有天然蛋白的加工机制,当然也包括了抗体蛋白的糖基化修饰,这样所生产出来的单克隆药物就与天然的蛋白十分接近,并且保证了治疗效果。单克隆药物的糖基化修饰主要是由寡糖连接到天冬酰胺的侧链,即N-连接,或者连接到丝氨酸/苏氨酸连接,即O-连接,如上文中提到的连接形式及种类。N端或者O端的多糖会影响单克隆抗体药物的蛋白活性,同时也决定了此种单克隆抗体药物在体内的半衰期。正是因为这些特点,抗体药物的糖型及糖基化修饰备受药品监管部门的重视,力求达到质量标准,以确保其有效性和安全性。

  在细胞培养过程中,决定单克隆抗体糖基化的主要因素有细胞表达系统、培养模式、生产工艺、培养基等,这几个方面都会改变抗体糖基化修饰,对单克隆抗体研究及生产等相关研究带来了巨大挑战。表2列举了细胞培养过程中影响抗体蛋白糖基化的各种变量。

  接下来我们将重点对细胞表达系统、培养模式、 生产工艺、 培养基等影响蛋白药物糖基化的研究进行总结。

  在抗体药物研发阶段,研究细胞表达系统对糖基化的影响十分关键。目前,商业化生产抗体药物的细胞表达系统主要是CHO细胞,少部分使用SP2/0、人纤维肉瘤细胞、人类淋巴母细胞、小鼠骨髓瘤细胞等。有报道表明CHO悬浮细胞表达人β-干扰素与微载体贴壁CHO细胞表达的干扰素具有相同的糖型。由相同组织分离的细胞表达的功能性酶种类也是多样化的,从而表达糖基化蛋白的能力也不同。CHO细胞中CHO-K1和 DUKX-B11都含有未激活的α(1,3)GalT基因,同样都有低水平的NGNA,CHO细胞表达系统在生产抗体药物时对糖基化修饰的影响是最普遍的。

  CHO细胞表达糖基化的机制同人类的IgG糖基化作用机制十分相似,仅有一些微小的不同之处。据报道,人的IgG末端唾液酸残基以α-2,6连接,CHO细胞来源的抗体以α-2,3连接。无论是人的IgG,还是CHO细胞表达来源的抗体,末端唾液酸残基的含量都很低。因此,唾液酸残基连接的不同对产品的质量可能不会造成影响。而且,许多人类血清糖蛋白也含有α-2,3连接的唾液酸残基。

  因此可见,宿主细胞系极大地影响了单克隆抗体的糖基化修饰类型,进而影响单克隆抗体治疗相关的安全性。对于生物制药产业来说,选择合适的宿主细胞系可以优化并控制糖基化修饰,进而提高产品的质量。

  细胞培养方式常见的有三种:批次培养、分批补料培养、灌流培养。不同的细胞培养方式会明显影响单克隆抗体药物的糖基化修饰,在灌流培养模式下糖基化总体水平较分批补料培养模式下的唾液酸化有所增加。总体来说,连续灌流培养的糖基化程度较批次培养要高,而批次培养模式下的细胞增长速度快,灌流培养模式下细胞生长速度越慢糖基化程度越高。当然选择哪一种培养方式取决于所生产的抗体药物自身糖基化情况。

  细胞生物反应器培养参数对细胞表达的抗体药物糖基化影响也十分显著。pH值在6.8~7.8变化时,半乳糖基化及唾液酸化程度达到近50%。氧不足同样会对抗体糖基化产生复杂的影响,溶氧变化在10%~90%时,半乳糖基化的变化量最大可达20%,唾液酸化的变化达30%。培养温度从37℃降至30℃,唾液酸比例也会由14%降至8%。降低温度可以延长细胞活力,从而提高所有蛋白表达,原则上也可以增加抗体糖基化。在生物反应器中温度的改变可以提高单位体积表达蛋白的活性,同时可维持糖型质量。

  此外,生物反应器中的剪切力也是一个非常重要的工程学变量,可影响抗体药物糖型修饰。在工艺放大或者现有工艺转移过程中剪切力是需要重点考虑的,监测剪切力对抗体糖基化不同表型的影响(例如从灌流培养到批式培养),同样是确保产品一致性非常重要的研究项。

  当然,细胞活力也是十分重要的因素,因为细胞胞外糖基化酶可以在培养基中逐步积累,并将单糖从聚糖上移除。对细胞活力等关键数据的测量应尽量保证准确,这对监测整个细胞培养过程极为重要,这不仅能够掌握细胞培养中的细胞参数,而且可以从这些细胞参数中获得细胞状态、细胞密度、细胞活力等第一手数据,对实验更加可控。在细胞活力的检测中贝克曼的Vi-CELL XR细胞计数和活力分析平台有效解决了细胞计数的误差,建立了统一的、标准的细胞计数及活力测定方法,跟踪培养细胞的各种状态参数,同时可以根据需要制作细胞生长曲线,帮助操作者有效地监管生物反应器(发酵罐)中的细胞状态,优化培养条件和培养参数。

  哺乳动物细胞培养基基本上由50~100种化学限定性物质组成,同时还有少数不确定物质作为补料,这些不确定物质包括蛋白胨、酵母抽提物、植物水解物和血清,已有文献报道一些不确定物质在糖基化蛋白中存在影响。目前,已明确的培养基成分如葡萄糖,谷氨酰胺,半乳糖等都在糖基化控制中担任了十分重要的角色。

  如上所述,经研究确证N-糖基化对于单克隆抗体药物的结构、功能以及药代动力学有显著的影响。因此,对于生物制药产业来说通过糖基化工程去控制特定糖结构的形成已然成为研究热点。在传统经典的人源化单抗和全人单抗的基础上,为了进一步优化效应功能和降低免疫原性,最直接的方法是以生产工艺为基础,通过代谢分析和数学模型的方法,进一步控制重组蛋白质的糖基化类型和糖基化修饰程度。

  糖基化修饰在治疗性抗体疗效、安全性及药代动力学等方面发挥着重大的作用。在现代单克隆抗体产业中,调整和控制糖基化修饰至关重要,通过糖基化工程去控制特定糖结构的形成也在不断地发展。通过总结过去的研究成果了解细胞代谢途径,希望最终可以控制单克隆抗体糖基化。未来目标是通过前期的基础研究,将新技术、新细胞系表达蛋白的糖基化水平做到可控并获得满足要求的糖蛋白,真正达到质量源于设计(QbD)的要求。

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